赤藓糖醇的制备方法主要为微生物发酵法。日本、韩国、比利时等均在研究开发赤藓糖醇。日本研究者从土壤、发酵食品、果实、花粉等采样进行分离、筛选、诱变育种得到了产赤藓糖醇的耐高渗酵母菌Aureoasidiumsp.SN-115,以葡萄糖为基质,赤藓糖醇的得率约为50%[2]。韩国Jinb.Park等筛选到一株耐高渗丝孢酵母Trichosporonsp.,该菌株在35℃条件下,发酵葡萄糖产生141g/L的赤藓糖醇,得率为47%[3]。台湾Shie-Jea Lin等筛选到28株赤藓糖醇产生菌,其中166-2菌株发酵30%的葡萄糖可产赤藓糖醇111.0g/L[4]。我国发酵法生产赤藓糖醇的研究开发工作起步较晚。无锡江南大学生工学院的范光先等筛选到一株单产赤藓糖醇的球状酵母OS-194,耗糖转化率达到29.6%[5]。作者对本实验室分离的赤藓糖醇产生菌B84512采用了中间补料流加葡萄糖的发酵工艺,大大提高了赤藓糖醇的发酵水平。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
菌种选自本实验室保藏圆酵母(Torulasp.)B84512。
1.1.2　试剂
赤藓糖醇标准品,Sigma公司产品;其它为分析纯试剂。
1.1.3　仪器
德国贝朗22L全自动发酵罐;上海分析仪器厂721分光光度计;岛津LC-10ASHPLC仪。
1.1.4　培养基与培养条件
1.1.4.1斜面培养基
葡萄糖200g,酵母膏10g,尿素1g,琼脂20g,自来水1000mL,pH6.0。
1.1.4.2　种子培养基
葡萄糖200g,酵母膏10g,尿素1g,自来水1000mL,pH6.0。
1.1.4.3　分批发酵培养基
Ⅰ.葡萄糖浓度30.0%,酵母膏含量为1.0%,尿素为0.1%,FeSO4·7H2O 0.001%,ZnSO4·7H2O 0.001%,pH 6.0,发酵液总体积12L。
Ⅱ.葡萄糖浓度40.0%,酵母膏含量为1.0%,尿素为0.
1%,FeSO4·7H2O 0.001%,ZnSO4·7H2O 0.001%,pH 6.0,发酵液总体积12L。
1.1.4.4　补料分批发酵培养基
       葡萄糖浓度30.0%,酵母膏含量为1.0%,尿素为0.1%,
FeSO4·7H2O 0.001%,ZnSO4·7H2O 0.001%,pH 6.0,发酵液初始体积9.6L,当糖度降至20%左右时以0.1L/h的速率流加80.0%浓度的葡萄糖液共2.4L。
1.1.4.5　发酵过程控制
       发酵温度34℃,通气量0.5vvm,菌体生长期控制溶氧为30%,50h后调整溶氧为15%,直至发酵结束。
1.2　方法
1.2.1　葡萄糖含量测定:3,5-二硝基水杨酸比色法[6]。
1.2.2　赤藓糖醇含量测定
1.2.2.1　化学法[7]
       取适当稀释样品0.5ml,加高碘酸试剂0.5ml混匀,静置8min,加氯化亚锡试剂0.5ml,混匀,加变色酸试剂5ml振摇后,沸水浴30min冷却,于570nm测定光吸收值,然后按已得到的光吸收值与标准品浓度的回归方程计算。
1.2.2.2　HPLC(高压液相色谱法):
       色谱柱:Hypersil NH2(4.6×250mm ,5μm)
       柱　温: 30℃
       流动相:乙晴-水(85:15)
       流动速率:1ml/min
       检测器:Waters 600/2410(示差折光检测器)
2　结果与讨论
2.1　葡萄糖浓度对发酵产赤藓糖醇的影响
       试验了不同葡萄糖浓度发酵产赤藓糖醇的情况,培养基中葡萄糖浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%,酵母膏含量为1.0%,尿素为0.1%,FeSO4·7H2O浓度0.001%,ZnSO4·7H2O浓度0.001%,pH 6.0,34℃培养5d。结果见表1。由表1可见,葡萄糖浓度为30%、40%时发酵赤藓糖醇转化率较高。

2.2　22L全自动发酵罐试验
       在22L发酵罐发酵试验中,进行了分批发酵及补料分批发酵试验。结果如图1(A、B、C)所示。

  

       从图1A、图1 B可以看出,当葡萄糖浓度为30%时,40h左右酵母细胞生长进入稳定期,110h赤藓糖醇产量达到112.9g/L,生产率1.03g/L·h;当葡萄糖浓度为40%时,60h左右酵母细胞生长进入稳定期,140h赤藓糖醇产量达到159.5g/L,生产率1.14g/L·h,这是由于葡萄糖浓度太高,延滞了细胞的生长,推迟了发酵时间,但从生产率看,初始葡萄糖浓度为40%时较高,故考虑采用流加补料发酵工艺。图1C初始葡萄糖浓度30%连续补加葡萄糖浆使总糖浓度达到40%的发酵过程曲线。从图1C可知连续补料,45h左右酵母细胞生长进入稳定期,与分批发酵基本相同,发酵120h可产赤藓糖醇162.5g/L,生产率为1.35g/L·h。故选择初始葡萄糖浓度30%、中间流加葡萄糖浆使总葡萄糖糖浓度达到40%的工艺路线。
3　结论
       利用赤藓糖醇高产菌种圆酵母(Torulasp.)B84512,通过控制发酵过程中发酵液葡萄糖起始浓度,中间流加葡萄糖方法使总葡萄糖糖浓度达到40%,能大大提高赤藓糖醇产量,发酵120h可产赤藓糖醇162.5g/L,生产率为1.35g/L·h.此工艺国内未见报道。