项目完成单位:国家生物医学分析中心
项目完成人:郑永红 杨松成 魏开华
功能性低聚糖是指对人、动物具有特殊生理作用的单糖数在2~10之间的一类寡糖,它的甜度一般只有蔗糖的30~50%,具有低热量、抗龋齿、防治糖尿病、改善肠道菌落结构等生理作用。它是当今食品科学与工程研究领域的前沿,被誉为“21世纪食品工业的先导”。
目前,
功能性低聚糖已被大量地用于各种医药制剂、口服液、保健品和含流汁病人的能源,主要包括大豆低聚糖、根霉低聚糖、麦芽低聚糖和低聚果糖等。如大豆低聚糖是从大豆蛋白质的水溶液中提取,主要成分是水苏糖、棉籽糖和蔗糖等寡糖,在生产大豆蛋白所排出的大豆乳清中其含量较高,而我国企业一直把它当废气物弃之,不但浪费资源,而且对环境造成严重污染。通过对大豆低聚糖的测定分析,可合理利用资源、降低成本。目前,日本已开发大豆低聚糖,将其列为“特殊健康用途的基料”。
大豆低聚糖是大豆中低分子量糖类的总称,其主要成分是水苏糖、棉子糖和蔗糖等寡糖。其中蔗糖是由α-D -葡萄糖和β-D- 果糖以α-1,2糖苷键结合而成;而棉子糖和水苏糖则是在蔗糖结构中的葡萄糖之C6位以α-1,6糖苷键又分别结合了一分子和二分子的半乳糖,均属非还原糖,其化学结构见下图。因人体消化系统中不存在α-1,6糖苷键的酶,大豆低聚糖不能被人体消化吸收和利用。大豆低聚糖有类似于蔗糖的甜味,甜度为蔗糖70%,热值为蔗糖50%,发热量为2卡/克,大豆低聚糖可以替代蔗糖作为低热能量甜味剂。
在
功能性低聚糖的生产过程中,因产品及加工方式的不同,其含量和成分也会发生不同程度的变化,因此对于医药企业而言,建立一套操作简单、测定速度快、准确性高的检测方法,对于指导生产至关重要。本文进行了这方面的研究,取得了满意的结果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
(1)气相色谱仪:美国惠普公司HP5890型气相色谱仪,HP3396A数据处理机。
(2)糖标准品:蔗糖、水苏糖、棉籽糖均购于美国Sigma公司。
(3)试剂:二甲基亚砜、六甲基二硅氨烷、三甲基氯硅烷、环己烷、肌醇(内标物),均为分析纯试剂。
(4)大豆低聚糖粗品:购于上海交大昂立股份有限公司。
1.2 样品制备
1.2.1大豆低聚糖的分离和纯化
粗品用石油醚脱脂,80%乙醇脱单糖,热水浸提低聚糖,乙醇沉淀,干燥后经Savag法脱游离蛋白,20%H2O2脱色,透析脱盐,浓缩后取样上DEAE纤维素柱,依次用水、0.05mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl洗脱,分部收集。透析脱盐,浓缩后冷冻干燥得到精制的大豆低聚糖。
1.2.2衍生化方法
由单因素影响试验得出适宜的衍生化-萃取条件为:称取1.0g精制品和0.15g肌醇,于磨口三角瓶中,加20mL水,置于60℃水浴提取1h,冷却过滤后,滤液缩干燥,加入2.0mL二甲基亚砜,使其溶解后,加入10mL环己烷萃取;加入1.0mL衍生化试剂(六基二硅氨烷:三甲基氯硅烷=2:1),振荡10min,静止50min,取1mL上清液进行气相色谱测定。空白样品处理同上。
1.3标准曲线的绘制
称取蔗糖、水苏糖、棉籽糖和肌醇(内标)约300mg于50mL容量瓶中,加水定容到刻度,作为标准溶液。将标准溶液稀释成一系列浓度,按样品处理方法,经衍生化后,备色谱测定用。取每种上清液进样3次,每次1ul。以各糖类物质的浓度与内标的浓度比作为横坐标,各糖类物质的峰面积(水苏糖和棉籽糖为二个峰面积之和)与内标峰面积比作为纵坐标,得出各糖类物质的内标法工作曲线。各工作曲线的r2均大于0.99,蔗糖、水苏糖、棉籽糖的线性范围分别为4.2~42mg/L,6.4~64 mg/L和5.6~56mg/L。将标准溶液稀释一定倍数,以S/N=2计, 蔗糖、水苏糖、棉籽糖的最小检测浓度分别为14μg/L、21μg/L、19μg/L。
1.4气相色谱条件
色谱柱HP-1(GcosslinkedMethylSiloxane),30m×0.32mm×0.25μm;氢火焰离子化检测器(FID),以高纯氮为载气(流速20ml/min),检测器和进样口的温度均为280℃,升温程序如下:150℃保持4min,以10℃/min速度,升温至160℃保持8min,以5℃/min速度,升温至180℃保持2min,再以20℃/min速度,升温至250℃保持5min;内标选用肌醇;分流比为50:1,分流进样,进样量为1mL。所得色谱图见图1,溶剂峰约在3min出。
图1 大豆低聚糖衍生物的色谱图
1-肌醇; 2-蔗糖;3,6-水苏糖; 4,5-棉籽糖
2 实验结果
2.1方法的回收率
回收率试验采取实际样品添加标样的方法测定,取3份平行样分别加入一定量的蔗糖、棉籽糖和水苏糖标准品,与1份样品自身测定组同时同条件测定,测得蔗糖、棉籽糖和水苏糖的回收率结果见表1。
表1 大豆低聚糖的回收率试验结果
糖类 |
加入量(mg) |
实测量(mg) |
回收率,% |
蔗糖 |
25.54 |
24.71 |
96.77 |
|
28.30 |
28.00 |
98.93 |
|
26.96 |
27.01 |
100.16 |
棉籽糖 |
20.83 |
20.55 |
98.67 |
|
22.74 |
21.25 |
93.46 |
|
21.58 |
20.40 |
94.55 |
水苏糖 |
24.57 |
24.28 |
98.84 |
|
25.41 |
23.82 |
93.75 |
|
25.36 |
25.21 |
99.40 |
2.2 大豆低聚糖的含量测定结果
分别称取大豆低聚糖粗品5.0g及精制品1.0g, 各4份,按上述样品处理条件,进行气相色谱测定,结果见表2。
表2 大豆低聚糖样品中糖含量测定结果(%)
名称 |
蔗糖 |
RSD |
棉籽糖 |
RSD |
水苏糖 |
RSD |
低聚糖总量 |
大豆低聚糖(精制) |
59.65 |
2.55 |
5.56 |
2.51 |
17.54 |
3.42 |
82.75 |
大豆低聚糖(粗品) |
15.77 |
3.07 |
1.85 |
3.33 |
7.81 |
3.89 |
25.43 |
3 讨论
糖类的传统分析方法是采用化学法测定总糖和还原糖,由于样品有颜色或含有其它还原性物质时,分析结果准确性很差,而且不能测出样品中每种糖的含量。在本实验中,曾采用将干燥后的样品溶于无水吡啶中进行硅烷化。该方法主要存在以下三种不利因素:1)样品在吡啶中难于溶解而且需要时间长;2)衍生化后样品浑浊(可能是由于生成氯化铵所至),放置一段时间后,溶液下部有沉淀物;3)吡啶流出宽而拖尾的峰,使定量结果不准确;4)吡啶有较大的毒性。使用二甲基亚砜-环己烷为溶剂,则可避免上述问题。在使用本方法时有两个问题需要注意,第一:在加入三甲基氯硅烷后,应注意衍生化反应是放热反应。尤其在样品中糖含量较高时,首先应缓慢摇动约3min后再放入超声波震荡器中,以免发生危险;第二:在使用FID时,因衍生化产物在燃烧时会产生二氧化硅附在收集极上,导致灵敏度下降,尤其使用填充柱时,由于进量大更为严重。因此,应定期用乙醇或丙酮清洗检测器收集极。
因为糖类物质易溶于水和乙醇, 一般利用80%乙醇做提取剂后,需加入PbAc2和K2C2O4,实验中我们发现该物质虽能吸附部分蛋白类、果胶类物质,但也会吸附少量的糖,因此实验中应少加或不加入PbAc2和K2C2O4。另外,在减压蒸馏时应充分蒸干,必要时可在真空干燥器内干燥,以避免水和乙醇对衍生化反应的干扰。
参考文献
[1]王静等.色谱法在糖类化合物分析中的应用.分析化学,2001,2:222-227
[2]汪云.糖品组分及糖替代品的气相色谱分析.冷饮与速冻食品工业,1998,3:23-26
[3]章满等.GC法测定人血红细胞膜上中性糖、氨基酸及唾液酸的含量.中国卫生检验杂志,2001,11(5):540-541