2. 双歧杆菌的检测方法

目前，双歧杆菌的检测技术主要可分为两大类，一类是以传统的平板菌落计数为基础的检测技术;另一类是以分子生物学为基础的各种检测技术。

2.1双歧杆菌常规检测技术进展

与其它细菌一样，双歧杆菌的常规检测技术主要是各种表型特征、化学分类性状、血清学特征等为依据的。目前市场上双歧制品多以双歧制品与嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等双菌或多菌联用。因此，双歧杆菌常规检测技术的主要目的就是将之与其混合培养的其它菌种分离开来。

2.1.1双歧杆菌的选择性培养基检测

双歧杆菌选择性计数的原理是在培养基中添加抑制其它菌群的抗生素，或采用棉子糖、低聚糖等其它菌群无法利用的糖类，从而达到选择性检出双歧杆菌的目的。添加的抗生素主要包括：新霉素、巴龙霉素、萘啶酮酸、氯化锂等。由于双歧杆菌内种不同，到现在还没有一种通用的双歧杆菌培养基可用于全部双歧杆菌的选择性检测。值得注意的是，有许多双歧因子，如西红柿汁、肝浸汁、乳糖糖浆、人乳清-(2,6)-果糖低聚糖等^[3]，均可促进双歧杆菌的生长。可在双歧杆菌培养基中添加这些物质以促进双歧杆菌的生长。加富布氏培养基（AMC）和添这些物质以促进双歧杆菌的生长。加富布氏培养基（AMC）和添加半胱氨酸的MRS培养基被认为是工业品控实验室的较佳选择^[4] 。

2.1.2双歧杆菌ELISA检测技术

ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种高效的免疫学检测方法。测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。洗涤，使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，使之反应并结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入可与酶反应的底物后，底物被催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。反应中酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使得测定方法达到很高的敏感度。近\年来许多学者报道了使用此方法检测样品中的双歧杆菌。

2..1.3   双歧杆菌酶学检测技术

双歧杆菌属中大多数细菌细胞的抽提物中具有F6PPK。 一般认为检测出F6PPK可作为鉴定双歧杆菌属细菌的重要特征之一。。E. Vlkova^[5]等对F6PPK、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶的活性进行检测，并将检测结果与经典培养计数法、荧光原位杂交法的结果进行比较，并无明显差异。 所有的阳性样品均表现较高的α-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酶活性， 而阴性样品缺乏此两种酶一种或两种的活性。且所有的阴性样品均不表现F6PPK活性。 此外，许多相关研究中也经常采用检测F6PPK酶活的方法来作为参照^[6]。

2.2双歧杆菌分子生物学检测和鉴定技术进展

传统的细菌生化反应并不能有效地对各种生境分离出来的菌株进行分类和鉴定，所以只有采取多种手段并用，即采用基因型和表型特征相结合的办法才能够对不同的双歧杆菌菌株进行分类。随着近年来分子生物学发展，采用分子生物学方法对双歧杆菌进行属、种、株水平鉴定已有较大进展。

2.2.1   特异性核酸前体或探针直接检测

通过对细菌rDNA序列进行分析，尤其是对16S rDNA序列进行分析，可以从基因序列中得到不同种系发生水平的多个区域的特定基因信息，如科、属、种及亚种水平的基因信息。因此，可以通过检测某种或某些种微生物的特定序列来证明其存在。但这需要精确设计科特异性探针、属特异性探针和种特异性探针

作为前提。寡核苷酸探针法可以直接检测特异核苷酸序列。其一般操作是提取样品DNA或RNA，固定在正电荷膜（尼龙膜，硝化纤维膜）上，然后用放射性标

记、化学荧光标记或地高辛标记的探针或DNA片断与之杂交，检测信号即可得出阳性结果。近年来报道的各种双歧杆菌属/种特异性前体或探针已有很多。此类技术包括各种点杂交技术（Northern/Sorthern杂交及荧光原位杂交等）及最近几年发展起来的DNA微阵列技术(DNA microarrays)。

2.2.2   DNA微阵列技术

DNA微阵列技术的原理是将大量DNA探针固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱来判断样品中分子的数量。可在一块

支持物上对成百上千的目标DNA进行同时检测。R. F. Wang^[7]用此方法检测了人体肠道中常见的20种菌（其中包括3种常见的双歧杆菌）。此技术也可用于益生菌制品中双歧杆菌及其它益生菌的同时检出。

2.2.3     FISH荧光原位杂交

在荧光原位杂交（FISH）中，目标rRNA序列的检测由荧光标记的寡核苷酸探针杂交来实现。此技术需要特殊的步骤来改变细胞的通透性以使探针进入细菌

的细胞中。当细菌中的rRNA分子捕捉到探针后，使用荧光显微技术或血细胞计数的方法检测或计数细菌细胞。Arthur C. Ouwehand^[8]报道用FISH方法检测摄食益生菌产品后人粪便样品中的乳酸双歧杆菌Bb-12。

2.2.4   分子标记技术

分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列。理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)高的多态性；(2)共显性遗传，可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速；(8)成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好。此类的实验技术包括：RFLP（限制性片段长度多态性）；RAPD（随机扩增多态性DNA）；AFLP（扩增片段长度多态性）和SNP（单核苷酸多态性）及近年来发展起来的较新的ARDRA（扩增DNA限制性分析）等。以下简要介绍其中两种。

2.2.5   ARDRA（扩增DNA限制性分析技术）

ARDRA即扩增DNA限制性分析技术，其原理是用限制性酶切扩增DNA产物，得到含细菌遗传信息的特异性图谱。ARDRA分辨率依赖所使用的限制性内切酶和所扩增的DNA长度而定，可鉴别细菌到种或亚种水平。此技术重复性较好，但其分辨率不及RPAD。

2.2.6   RAPD（随机扩增多态性DNA技术）

随机扩增多态性DNA技术(RAPD)   是以PCR为基础的分子标志技术。它是根据PCR 原理以人工随机合成的寡核苷酸为引物对研究对象的基因组DNA进行扩增,扩增出的不同片段经琼脂糖凝胶电泳后呈现出一定形式的谱带(DNA指纹图谱)。 由于RAPD在分析DNA多态性方面具有快速简便等特点,因此广泛地应用于微生物菌种的分子分类与鉴定。

2.3   PCR相关技术

PCR（聚合酶链反应）是基于天然DNA复制规律而设计的一种特异性DNA靶序列体外扩增方法。由PCR反应直接扩增DNA是一种最简单最直接的检测特殊序列的方法。 目前已建立了应用PCR方法检测多种致病菌及病毒的方法，如志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、甲肝病毒等的快速检测。近年来，国内外不少学者先后将PCR法应用于双歧杆菌的鉴定并取得了长足的进展。

2.3.1   实时PCR（real-time PCR）

实时PCR又称荧光定量PCR或TaqMan     PCR， 是在常规PCR基础上运用荧光能量传递（FRET）技术，加入荧光标记探针，巧妙把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。 一方面提高了灵敏度， 另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值， 从而根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。另外由于CT值是一个完全客观的参数，CT值越小，模版DNA的起始拷贝数越小。因此，利用CT值确定DNA拷贝数的实时PCR方法比普通终点定量方法更加准确。且与普通PCR相比，实时PCR分析更快，更准确，偏差更小，重现性更好。

2.3.2   多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)， 又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物， 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应， 其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 多重PCR可在同一PCR反应管内同时检出多种微生物， 或对有多个型别的目的基因进行分型，适宜于微生物区系的检测，如人肠道微生物的同时侦检。

2.3.3   Rep-PCR 细菌基因组重复序列PCR

Rep-PCR即细菌基因组重复序列PCR技术（rep-PCR） ，是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条带比较分析，来揭示基因组间的差异。细菌基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequence），包括常用的REP（repetitive Extragenic Palindromic,基因外重复回文系列） 、 ERIC（肠杆菌基因间重复一致序列）和BOX，它们在菌株、种、属水平上分布有差异，在进化过程有相对保守性。Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类，此方法操作方便，可以大样本进行，且分辨效果好，重复性好，并可实现自动化分型。

2.4   细菌群落分布技术

PCR-DGGE（PCR-失活梯度凝胶电泳技术）被认为是可不依赖培养的快速、特异性高的细菌鉴定方法。其原理是用特异性前体或探针PCR扩增后， 用失活梯度凝胶电泳来分离扩增产物，同种的细菌在失活梯度凝胶上表现相同的迁移率，可以用于检测细菌群落分布。DGGE图谱的条带可将细菌鉴定到种水平。 许多学者用此方法研究了益生菌制品中的菌落分布（多数为双歧杆菌和乳酸菌）。

     对于双歧杆菌的检测和鉴定而言，传统的生理生化技术正逐步被分子生物学技术所取代。但由于其技术要求低，操作方便，结果直观，在许多方面仍有广泛应用。而各种分子生物学检测技术由于可以提供更为准确可靠的双歧杆菌分类信息，且不依赖培养，所以具备更大的潜力。随着双歧杆菌微生态学和生理生化功能的研究及分子生物学本身的发展而发展，其方向是实时，高效，快捷，准确，低价。各种分子生物学技术在分辨率，重复性，可操作性等方面各有优势，将会极大地推动双歧杆菌的研究进展^[9]。